RNA转录本的空间分布信息对于揭示细胞及亚细胞水平的生物学互作至关重要。然而，目前高分辨率的成像方法在空间组学研究中仍面临诸多挑战：常规荧光显微镜受通道限制，通常最多仅能同时检测不超过五种标记；基于多轮流体反应的洗脱-再标记荧光原位杂交或原位测序等方法虽可提高检测的多重性，但依赖复杂的流体控制装置，成本高且通量受限，难以普及。此外，试剂的多轮渗透和长实验周期带来的组织形变对于三维厚组织检测也带来了极大挑战。因此，开发简便、无需流体控制且兼容三维样品的高通量空间组学成像技术成为亟待解决的难题。
本研究开发了一种基于单轮染色-成像的方法，称为PRISM（Profiling of RNA In-situ through Single-round iMaging），仅依赖常规荧光显微镜和实验条件就可以对数十种核酸序列进行亚微米分辨率的原位检测，整个实验流程可在一天之内完成（图1）。PRISM利用挂锁探针和滚环扩增的方法对待测核酸分子的信号进行放大，而挂锁探针的条形码由特定的短序列组合而成，而后通过解码探针的杂交而产生不同发射波长的荧光标记与不同强度级别的组合。对于一个特定的编码，其中强度级别的实现是通过按照特定比例混合“亮”和“暗”的一对序列完全一致的解码探针而得。在染色时，这一对探针通过竞争结合使相应百分比的荧光基团结合到扩增产物上从而呈现强度的分级。
图1 .PRISM的工作流程与编码原理。a. PRISM在挂锁探针上的条形码设计。b. PRISM流程中转录本信息的读出过程。c. 通过混合解码探针进行一次性染色和成像。d.米乐 登录入口 PRISM的实验工作流程。e. 采用径向矢量筛选确保编码的区分度。f. 色彩空间中的基因解码。g. 原始图像中对应30种不同编码的荧光信号点。 h. 解码出的基因坐标点。i. 30个解码基因的空间分布。
为了避免各个核酸分子滚环扩增时效率的差异对解码的影响，PRISM采用“径向矢量”筛选策略，确保最终采用的色彩编码可区分性。通过这种编码策略，PRISM可以在无需流体控制或多轮反应的情况下，利用普通荧光显微镜的四个成像通道即可进行至多64种核酸分子的图像解析。此外，其单轮荧光染色与成像的策略由于避免反复的试剂渗透-成像循环，很好地兼容了三维厚组织样品。
该研究在小鼠的脑组织、胚胎以及人肝细胞癌样本中分别进行了方法验证。作者通过多张间隔采样的组织切片构建了E12.5-E14.5三个发育阶段的小鼠胚胎细胞图米乐M6 米乐平台谱，覆盖超过420万个类型注释的细胞，清晰地描绘了不同器官在各发育阶段的细胞组成及组织结构；通过20张连续切片构建了HBV阳性的肝癌-组织边界准三维图谱，描述了肿瘤相关纤维对免疫浸润的阻隔作用以及肿瘤和免疫响应的区域异质性；对100微米厚的鼠脑组织厚切片进行了直接检测，得到精确的三维空间中的细胞排布以及 RNA 的亚细胞RNA的分布。
PRISM 技术的推广可以使得广大生物学实验室无需复杂的流体控制装置即可实现数十种核酸靶标的高通量原位检测，从而推动空间组学成像技术的普及性和在分子病理诊断上的应用。
论文通讯作者是北京大学生物医学前沿创新中心/化学与分子工程学院黄岩谊教授和北京大学国际癌症研究院/北京大学肿瘤医院郑春红研究员。北京大学研究生常天翊、赵诗卉、邓昆月、廖智钊、唐明川为本文共同第一作者。